過(guò)氧化氫酶是一種普遍存在于自然界的血紅素鐵酶，其活性主要是分解H2O2產(chǎn)生H2O和O2，以保護(hù)生物體不被過(guò)氧化氫所毒害，目前該酶的主要研究方向?yàn)镠2O2的分解機(jī)制及其生理功能，而過(guò)氧化氫酶的O2的代謝利用機(jī)制尚未見報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化氫酶EasC利用O2催化麥角生物堿核心骨架四并環(huán)結(jié)構(gòu)中C環(huán)合成時(shí)并不需要額外添加NADPH等還原劑，推測(cè)其可能代表著一種未知的氧氣激活與氧同化機(jī)制。
近日，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高書山團(tuán)隊(duì)與杭州師范大學(xué)郭瑞庭團(tuán)隊(duì)合作，破解了EasC蛋白底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并利用波譜測(cè)定、體外生化、同位素標(biāo)記和化學(xué)計(jì)算等手段，從分子水平闡明了EasC利用O2催化氧化環(huán)化反應(yīng)的新機(jī)制。團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)電鏡獲得EasC酶與底物PCC的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（2.33 ?），發(fā)現(xiàn)EasC呈現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)PCC并不是結(jié)合在heme口袋上方，而是結(jié)合在過(guò)氧化氫酶共有的NADPH口袋，該位置距離heme口袋20.7 ?，兩口袋之間通過(guò)一個(gè)狹長(zhǎng)活性氧傳輸通道相連。為了探究EasC參與催化反應(yīng)的鐵氧復(fù)合物類型，隨后團(tuán)隊(duì)對(duì)酶的波譜特征進(jìn)行了檢測(cè)。在有氧條件下，將底物PCC和EasC酶（靜息態(tài)Fe(III)）進(jìn)行快速混合，使用停留色譜檢測(cè)到了416、544 和590 nm的最大吸收，該吸收明顯區(qū)別于血紅素酶已報(bào)道的鐵-氧復(fù)合體Compound I (Cpd I,Fe(IV)=O) 的最大吸收（408 和650 nm），反而與文獻(xiàn)報(bào)道的Compound III(Cpd III,Fe(III)-O2·-）吸收一致，表明EasC中的血紅素鐵可能以Cpd III的方式參與催化反應(yīng)。進(jìn)一步的電子順磁共振和紫外吸收測(cè)試表明，在有氧條件下，靜息態(tài)EasC的Fe(III)接收底物電子并與O2結(jié)合耦合、直接形成Cpd III。由于Cpd III可以分解生成超氧陰離子（O2·-）并回歸到靜息態(tài)Fe(III)，團(tuán)隊(duì)推測(cè)EasC催化過(guò)程可能由超氧陰離子介導(dǎo)。因此該研究進(jìn)一步通過(guò)活性氧抑制實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子恢復(fù)實(shí)驗(yàn)以及18O標(biāo)記的超氧陰離子自由基競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，鑒定出氧氣被活化成超氧陰離子（O2·-）的活性氧形式、參與底物的轉(zhuǎn)化，而非傳統(tǒng)的鐵-氧復(fù)合物轉(zhuǎn)化底物。
基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，團(tuán)隊(duì)提出了基于活性氧超氧陰離子的反應(yīng)機(jī)制：i)結(jié)合在NADPH口袋的底物PCC，其吲哚氨基將一個(gè)電子傳遞給血紅素口袋的Fe(III)，后者同時(shí)和氧氣結(jié)合形成Fe(III)-O2·- (Cpd III)；ii)Cpd III進(jìn)一步分解成Fe(III)和超氧陰離子（O2·-），生成的超氧陰離子通過(guò)兩個(gè)口袋之間的ROS通道進(jìn)入NADPH口袋；iii)超氧陰離子與底物PCC結(jié)合，催化復(fù)雜的氧化環(huán)化反應(yīng)，完成麥角生物堿C環(huán)的合成。
綜上所述，該研究詳細(xì)闡明了麥角生物堿核心骨架C環(huán)的生物合成機(jī)制，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶EasC利用超氧陰離子實(shí)現(xiàn)氧氣激活，并進(jìn)一步催化氧化環(huán)化反應(yīng)。該機(jī)制代表了一種全新的血紅素金屬酶的催化模式，即氧氣無(wú)需形成活性鐵-氧復(fù)合物。同時(shí)，該研究也讓過(guò)氧化氫酶的相關(guān)研究從H2O2依賴性酶轉(zhuǎn)向O2依賴性酶，拓展了過(guò)氧化氫酶這一生物催化劑的研究領(lǐng)域。
該工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動(dòng)、湖北紅山實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目、杭州師范大學(xué)交叉學(xué)科研究項(xiàng)目以及中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)等項(xiàng)目支持，相關(guān)成果發(fā)表于Nature期刊。杭州師范大學(xué)陳純琪教授、博士生劉紫薇，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所客座博士生禹之璞、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所副研究員姚永鵬為本文的共同第一作者，高書山研究員和郭瑞庭研究員為本文的共同通訊作者。低碳合成工程生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)酶國(guó)家工程研究中心相關(guān)科研人員在本項(xiàng)工作中做出了重要貢獻(xiàn)。
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超氧陰離子（O2·-）催化麥角生物堿C環(huán)的合成機(jī)制
過(guò)氧化氫酶生成超氧陰離子催化麥角堿天然藥物分子生物合成示意圖 專家點(diǎn)評(píng)：
趙國(guó)屏（中國(guó)科學(xué)院院士，中國(guó)科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專家委員會(huì)主任）
超氧陰離子（O?·?）是在細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的一種活性氧自由基，通常認(rèn)為它具有損傷DNA、蛋白質(zhì)等生物毒性功能。另一方面，超氧陰離子在化學(xué)合成中已經(jīng)作為一種化學(xué)催化劑廣泛用于有機(jī)分子合成；那么，超氧陰離子是否可能在生物催化、生物合成中發(fā)揮作用，尚未得到揭示。近期，高書山課題組和郭瑞庭課題組合作，在體外催化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超氧陰離子參與天然產(chǎn)物分子的生物合成，并解析其機(jī)制；這一新的認(rèn)識(shí)，突破了超氧陰離子現(xiàn)有的毒性功能認(rèn)知。
在此項(xiàng)研究中，研究者綜合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、同位素化學(xué)以及波譜學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶EasC可以利用麥角生物堿底物提供的一個(gè)電子，在血紅素口袋直接將氧氣還原成超氧陰離子；后者可以進(jìn)一步通過(guò)超氧陰離子傳遞通道，輸送至位于蛋白表面的底物反應(yīng)位點(diǎn)，催化復(fù)雜、多步的自由基反應(yīng)，合成麥角生物堿天然產(chǎn)物分子。文章進(jìn)一步指出，這種由活性氧介導(dǎo)的生物催化機(jī)制極可能普遍存在于自然界，是一種普遍存在的金屬酶催化機(jī)制。因此，本研究不僅解析了過(guò)氧化氫酶EasC的一種特別有趣的前所未知的催化機(jī)制，更重要的是界定了超氧陰離子的生物催化功能。它向人們揭示了超氧陰離子在生命活動(dòng)中的雙重功能特性，即既是細(xì)胞代謝中不可避免會(huì)產(chǎn)生的具有毒性的副產(chǎn)物，又可能在生物合成過(guò)程中成為催化工具、參與天然產(chǎn)物合成；從而提示人們應(yīng)全面認(rèn)識(shí)超氧陰離子的作用，并根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，注意恰當(dāng)?shù)姆雷o(hù)或利用。
鄧子新（中國(guó)科學(xué)院院士，上海交通大學(xué)微生物代謝全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任）
在微生物細(xì)胞內(nèi)，O2需要在氧化酶/加氧酶的激活下，作為親電試劑通過(guò)酶促反應(yīng)整合至代謝產(chǎn)物的含氧官能團(tuán)（如羥基、羰基等）中、產(chǎn)生特定生物功能的結(jié)構(gòu)單元。常見的氧化酶O2激活路徑為：酶結(jié)構(gòu)中的有機(jī)輔酶或金屬輔因子利用還原劑的電子還原O2、形成輔酶-O復(fù)合體/輔因子-O復(fù)合體；上述復(fù)合體進(jìn)一步來(lái)催化底物的氧化/加氧等生物化學(xué)反應(yīng)。這一典型O2激活路徑被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可，在教科書中關(guān)于酶的催化機(jī)制闡釋中被廣泛引用。
高書山課題組和郭瑞庭課題組合作，圍繞真菌天然藥物麥角生物堿合成酶EasC的生物催化機(jī)制解析，捕獲到一種新O2活化機(jī)制。該機(jī)制由三部分組成，第一，底物直接為血紅素Fe(III)供電子，徹底擺脫對(duì)NADPH的依賴；第二，通過(guò)Fe(III)-O?·?中間體的瞬時(shí)生成，將危險(xiǎn)的超氧陰離子（O?·?）轉(zhuǎn)化為可控的催化"手術(shù)刀"；第三，疏水傳輸通道確保活性氧分子精準(zhǔn)導(dǎo)航至底物反應(yīng)位點(diǎn)。此種O2激活模式下的EasC酶利用超氧陰離子作為自由擴(kuò)散型催化工具，成功解耦過(guò)氧化氫酶生化反應(yīng)的空間限域性。
這種基于超氧陰離子的O2激活模式突破了傳統(tǒng)酶促氧代謝的輔酶-O/輔因子-O等復(fù)合體催化理論框架。這一發(fā)現(xiàn)證明了自然界血紅素酶等金屬酶催化的功能和機(jī)制的多樣性，為人工設(shè)計(jì)高效生物催化劑開辟全新路徑，在生物制藥、綠色化工等領(lǐng)域具有重大應(yīng)用潛力。
李盛英（山東大學(xué)教授）
血紅素酶是自然界中含量最豐富且功能最多樣的生物催化劑之一，其介導(dǎo)的氧化反應(yīng)在細(xì)胞外源物降解、代謝產(chǎn)物生物合成中發(fā)揮著核心關(guān)鍵作用。由于大氣中的O?分子處于熱力學(xué)穩(wěn)定態(tài)，其直接參與生物合成反應(yīng)存在顯著動(dòng)力學(xué)勢(shì)壘，因此對(duì)于血紅素酶催化的氧化反應(yīng)過(guò)程可以分為兩個(gè)階段：O2激活和底物轉(zhuǎn)化。在NADPH提供電子的前提下，酶通過(guò)血紅素鐵激活還原O2，形成Fe-O復(fù)合物（Compound I/II/III），進(jìn)而轉(zhuǎn)化底物。這種鐵-O復(fù)合物模式要求底物結(jié)合于血紅素上方，且氧氣激活與底物轉(zhuǎn)化發(fā)生在同一口袋，這種"面對(duì)面"的工作模式，嚴(yán)重限制了復(fù)雜分子的合成空間。
近期，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高書山團(tuán)隊(duì)與杭州師范大學(xué)郭瑞庭團(tuán)隊(duì)在《自然》發(fā)表的成果揭示了一種雙口袋、遠(yuǎn)程協(xié)同催化模式。在該研究中，高書山團(tuán)隊(duì)和郭瑞庭團(tuán)隊(duì)合作，通過(guò)冷凍電鏡解析了麥角生物堿合成酶EasC的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)麥角生物堿底物結(jié)合于NADPH口袋而非傳統(tǒng)血紅素口袋，并通過(guò)一個(gè)狹長(zhǎng)的疏水隧道實(shí)現(xiàn)血紅素口袋與底物口袋的協(xié)同催化。通過(guò)停流光譜、EPR以及紫外-可見光譜等技術(shù)證實(shí)了血紅素-鐵的Compound III（Cpd III）中間體的存在，并創(chuàng)新性地提出Cpd III可以分解生成超氧陰離子（O?·?），后者通過(guò)隧道傳遞介導(dǎo)麥角生物堿C環(huán)形成的自由基級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
這種機(jī)制相當(dāng)于在針尖上建起兩座不同化工廠，分別生產(chǎn)活性氧和藥物分子，并通過(guò)分子級(jí)"特快專列"傳遞催化指令。在該機(jī)制中，底物無(wú)需直接接觸Fe中心與O2，O2激活與底物轉(zhuǎn)化分別在獨(dú)立區(qū)域完成。這種空間分離不僅顯著擴(kuò)展了底物轉(zhuǎn)化的三維空間，還實(shí)現(xiàn)了多步自由基氧化環(huán)化反應(yīng)的精準(zhǔn)調(diào)控。因此，該研究發(fā)現(xiàn)突破了血紅素酶?jìng)鹘y(tǒng)的Fe-氧復(fù)合物催化范式，為自然界廣泛存在的血紅素酶催化機(jī)制研究提供了新視角。
陳義華（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所研究員，微生物資源與生物技術(shù)研究室主任）
微生物次級(jí)代謝蘊(yùn)藏了豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性，是抗生素、抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物分子的重要來(lái)源。為了合成結(jié)構(gòu)各異的次級(jí)代謝產(chǎn)物，微生物進(jìn)化出了突出的酶催化元件多樣性。對(duì)微生物藥物分子的生物合成研究有效拓展了酶催化機(jī)制的認(rèn)知邊界，為開發(fā)新型酶元件和發(fā)展合成生物學(xué)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
高書山團(tuán)隊(duì)前期在對(duì)麥角生物堿類藥物的研究中發(fā)現(xiàn)了特殊的過(guò)氧化氫酶EasC，它可以催化裸麥角堿C環(huán)的形成。在Nature最新發(fā)表的工作中，他們和郭瑞庭團(tuán)隊(duì)合作進(jìn)一步揭示了EasC的獨(dú)特催化機(jī)制，拓展了對(duì)氧化酶催化機(jī)制的認(rèn)知邊界。EasC突破了經(jīng)典過(guò)氧化氫酶僅催化H?O?歧化的功能局限，進(jìn)化出了一種前所未知的超氧陰離子（O?·-）介導(dǎo)的協(xié)同催化機(jī)制，催化形成了裸麥角堿的C環(huán)。
EasC對(duì)氧化還原酶經(jīng)典催化機(jī)制的挑戰(zhàn)在于：它并非利用活性的血紅素Fe-O復(fù)合物來(lái)催化反應(yīng)，而是在血紅素活化區(qū)分解血紅素Fe和氧氣形成的Compound III產(chǎn)生超氧陰離子，通過(guò)11.6?的疏水隧道擴(kuò)散至底物轉(zhuǎn)化區(qū)完成裸麥角堿的氧化環(huán)合。這種"自由基穿梭"機(jī)制為理解金屬酶催化中的電子-活性氧協(xié)同傳遞催化提供了全新的視角。更有意思的是，EasC采用的"雙位點(diǎn)-隧道協(xié)同"的催化架構(gòu)展現(xiàn)了微生物在利用有限的氧活化反應(yīng)類型的基礎(chǔ)上，進(jìn)化出的催化智慧：通過(guò)血紅素在活化區(qū)產(chǎn)生活性氧物種（ROS），在空間解耦的底物轉(zhuǎn)化區(qū)完成催化。將ROS的生成與利用進(jìn)行空間區(qū)室化，既避免了細(xì)胞毒性，又高效完成了氧化反應(yīng)，展現(xiàn)了酶對(duì)多步自由基級(jí)聯(lián)反應(yīng)的精準(zhǔn)時(shí)空調(diào)控。
微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成研究的突破不斷刷新我們對(duì)生物催化的認(rèn)知。不管是前期發(fā)現(xiàn)的不依賴任何輔基的氧化酶、不同類型的鹵化酶、Diels–Alder環(huán)化酶，還是該研究揭示的新型過(guò)氧化氫酶，都為認(rèn)識(shí)生物催化的多樣性、開發(fā)新型生物催化劑、重構(gòu)藥物分子生物合成途徑提供了寶貴的資源。
（原標(biāo)題：天津工業(yè)生物技術(shù)研究所等發(fā)現(xiàn)一種基于超氧陰離子的過(guò)氧化氫酶催化機(jī)制）
本文鏈接：http://jphkf.cn/news-8-2450-0.html我國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)基于超氧陰離子的過(guò)氧化氫酶催化機(jī)制
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