復旦學者在《細胞》（Cell）刊發(fā)最新研究成果，陸路、孫蕾、姜世勃團隊發(fā)現(xiàn)防治冠狀病毒的新靶點，并設計出高效雙功能抗病毒藥物。
2025年1月30日，復旦大學上海醫(yī)學院陸路研究員、孫蕾研究員、姜世勃教授團隊合作在《細胞》雜志以Research Article的形式在線發(fā)表了題為“Early fusion intermediate of ACE2-using coronavirus spike acting as antiviral target”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了ACE2受體誘導的冠狀病毒刺突蛋白早期融合中間態(tài)構象（E-FIC），并針對該中間態(tài)構象設計了高效、廣譜、兼具失活病毒和抑制病毒感染的雙功能抗冠狀病毒候選藥物。
1月30日，Cell《細胞》刊發(fā)的復旦學者陸路/孫蕾/姜世勃團隊研究成果。本文圖片均為復旦上醫(yī)供圖
解密ACE2受體誘導的冠狀病毒刺突蛋白早期融合中間態(tài)構象
在包膜病毒入侵宿主細胞的過程中，一些病毒能夠借助其表面蛋白介導其包膜與宿主細胞膜融合，進而將遺傳物質注入細胞開啟感染進程。膜融合是病毒建立感染的關鍵環(huán)節(jié)之一。
近年來，眾多研究團隊成功揭示了SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2以及其他一些冠狀病毒S蛋白的RBD與受體結合的復合物構象，以及S蛋白三聚體與受體結合的融合前構象。姜世勃、陸路等研究團隊也發(fā)現(xiàn)了MERS-CoV（Nature Communications 2014）、SARS-CoV-2（Cell Research 2020）等S蛋白HR1/HR2形成六螺旋的融合后構象。
但目前仍有一個關鍵問題尚未明確——刺突蛋白從融合前狀態(tài)轉變?yōu)槿诤虾鬆顟B(tài)時，究竟經歷了怎樣的構象變化。雖然已有研究者發(fā)現(xiàn)新冠病毒S2亞基中間態(tài)構象，但是對于早期的融合中間態(tài)，特別是介于受體結合和S1亞基脫落之間的S蛋白構象是否存在，及其變構細節(jié)等還一直處于認知盲區(qū)。
此次，上述團隊首先利用流式細胞術，發(fā)現(xiàn)跨膜表達的S蛋白在受到ACE2蛋白胞外域的刺激后，能夠結合HR1抗體或其配體多肽EK1，而此時S1亞基還沒有脫落，提示可能存在一種不同于傳統(tǒng)觀點的早期融合中間態(tài)構象。為了捕獲并直觀地呈現(xiàn)S蛋白的這種中間態(tài)構象，研究團隊對S蛋白與ACE2胞外域共孵育產物進行冷凍電鏡顆粒篩選。通過長時間的摸索，研究者成功發(fā)現(xiàn)并解析了一種高分辨率（3.45 ?）的早期融合中間態(tài)構象（E-FIC）。
在E-FIC中，S2亞基發(fā)生了構象轉變，其中HR1三螺旋結構彈出，而S1亞基組成環(huán)狀結構結合在S2亞基的底部。通過進一步的結構優(yōu)化和分析，研究者發(fā)現(xiàn)在E-FIC S2亞基的HR1上結合著一段氨基酸序列，將其命名為中間態(tài)環(huán)——IL770。值得注意的是，S2’位點就位于IL770中，且突出于結合表面形成隆起，這種結構特征有利于蛋白酶的切割。
此外，通過上述構象可以推測蛋白酶對S2’位點的切割可能觸發(fā)IL770從HR1表面剝脫，從而釋放空間以利于HR2結合。通過對融合前和E-FIC結構的對比分析，研究者進而發(fā)現(xiàn)S蛋白結合ACE2受體后，S1亞基和S2亞基底部均會向細胞膜方向旋轉以實現(xiàn)病毒膜和細胞膜初步拉近，這將有助于縮短融膜肽插入細胞膜所需的距離。
SARS-CoV-2 S蛋白在誘導膜融合過程中經歷的構象變化。
設計高效雙功能抗病毒候選藥物
通過對E-FIC結構的分析，研究者還發(fā)現(xiàn)S1亞基中的RBD與S2亞基中的HR1之間的空間距離被拉近，這一發(fā)現(xiàn)也為靶向該中間體的藥物設計提供了新思路。
E-FIC中RBD與HR1之間的空間距離拉近。
基于此構象，研究者選用了經臨床試驗證明具有較好活性和安全性的RBD結合藥物候選（ACE2蛋白）和HR1的結合藥物候選（EK1多肽），設計出雙功能域串聯(lián)藥物候選。
由于E-FIC結構中HR1表面被IL770所結合，研究者通過競爭性結合實驗發(fā)現(xiàn)，EK1多肽能夠憑借強大的相互作用從IL770中奪取HR1進行結合。隨后，為了驗證雙功能域之間最佳連接子長度，研究者通過表達含有2、5、6、7組連接子的蛋白進行活性篩選，發(fā)現(xiàn)由 5組連接子串聯(lián)的蛋白（AL5E）具有最佳靶點結合活性和廣譜性。
后續(xù)研究結果表明，上述設計的蛋白類抗病毒活性分子具有失活病毒和抑制病毒雙功能。
一是從失活病毒功能方面看，AL5E蛋白上的ACE2功能域誘導游離病毒表面的S蛋白形成融合中間態(tài)，該中間態(tài)暴露出靠近ACE2的HR1區(qū)，隨后AL5E蛋白中的EK1功能域與HR1三聚體結合，造成病毒S蛋白鎖定在融合中間態(tài)，使該病毒粒子喪失感染活性。
二是從抑制病毒功能方面看，AL5E蛋白上的ACE2功能域和EK1功能域也可分別作為抑制劑，抑制病毒對靶細胞的感染。AL5E對新冠病毒及其變異株的抑制活性比ACE2蛋白提高26至623倍，對游離病毒的失活活性提高21至754倍。此外，AL5E對其他使用ACE2受體的冠狀病毒均具有很好的抗病毒效果。
同時，為了進一步探究所設計的雙功能分子在體內的活性。研究團隊借助新冠病毒變異株BA.5.2和人冠狀病毒NL63感染小鼠的模型，分別對AL5E蛋白在病毒感染治療和病毒失活方面的效果展開了評估。結果顯示，AL5E能夠顯著降低小鼠肺臟中病毒載量。
研究圖示
這些研究不僅揭示了冠狀病毒S蛋白在膜融合早期階段經歷的構象變化細節(jié)，還發(fā)現(xiàn)了其中的一些潛在藥物靶點，為深入探索冠狀病毒的膜融合機制及開發(fā)新型靶向性廣譜藥物或疫苗提供了新的思路。
復旦大學上海醫(yī)學院陸路研究員、孫蕾研究員和姜世勃教授為本文的共同通訊作者；邢立曉博士后、劉治民博士、王欣玲青年研究員和劉倩瑩博士為本文共同第一作者。
（原標題 復旦學者Cell發(fā)文：發(fā)現(xiàn)防治冠狀病毒新靶點并設計了雙功能抗病毒候選藥物）
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